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    實時熒光定量PCR系統的基本原理分析介紹
    點擊次數:819 發布時間:2021/4/7 14:46:58

      實時熒光定量PCR系統反應指的是在PCR進行的同時,對其過程進行監測,一般簡寫為。實時定量PCR與終點PCR的區別在于數據可在PCR擴增過程中進行收集。在實時熒光定量PCR中,反應以循環中檢測到目標擴增的時間點為特征,目標核酸的起始拷貝數越高,則會越快觀察到熒光的顯著增加(擴增曲線越靠近的X值越低)。相反,終點法檢測測量的是PCR循環結束時累計的PCR產物量。

      實時熒光定量PCR系統的基本原理:
      在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光基團,這些熒光物質有其特定的波長。儀器可以自動檢出,利用熒光信號積累,實時監測整個PCR進程,在PCR循環中,測量的信號將作為熒光閾值的坐標。并且引入一個——Ct值概念,Ct值是指產生可被檢測到得熒光信號所需的較小循環數,是在PCR循環過程中熒光信號由本底開始進入指數增長階段的拐點所對應的循環次數。

      熒光閾值相當于基線熒光信號的平均信號標準偏差的10倍。一般認為在熒光閾值以上所測出的熒光信號是一個可信的信號,可以用于定義一個樣本的Ct值。通常用不同濃度的標準樣品的Ct值來產生標準曲線,然后計算相對方程式。

      方程式的斜度可以用來檢查PCR的效率,所有標準曲線的線性回歸分析需要存在一個高相關系數,這樣才能認為實驗的過程和數據是可信的,使用這個方程式計算出未知樣本的初始模板量。實時熒光定量PCR儀都有軟件,可以從標準曲線中自動地計算出未知樣本的初始模板量。